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免疫組化SP法步驟
更新時間:2015-05-31   點擊次數(shù):1354次

按標記物質(zhì)的種類,如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等,可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法);按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合,如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法和親和連接,如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法等,其中SP法是zui常使用的方法。 
一般的sp法步驟啊,具體如下:
1.烤片,68℃,20分鐘,
2. 常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水;二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 
3.阻斷 滅活內(nèi)源性過氧化物酶:3%H2O2 37℃孵育10min,PBS沖洗3X5min;
4. 抗原修復:置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷卻20min 以上,再用冷水沖洗缸子,加快冷卻至室溫,PBS沖洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封閉,37℃10 min,傾去勿洗.
6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育過夜,PBS沖洗3X5min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照);
滴加生物素標記二抗, 37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;
7. 滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;
8. DAB/ H2O2反應染色,自來水充分沖洗后,
蘇木素復染,常規(guī)脫水,透明,干燥,封片。

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