我們知道,ELISA 測(cè)定中影響要素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,在檢驗(yàn)中除正常反響外,有時(shí)??梢姷揭恍╁e(cuò)誤結(jié)果(即假陽性或假陰性),那么致使試驗(yàn)不成功的主要原因有哪些咧?
標(biāo)本的影響:溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清選用ELISA法檢測(cè)易發(fā)生假陽性?;蛟S是溶血血清中含有過氧化酶物質(zhì)(紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素),在洗刷過程中往往難以*洗脫,它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O),從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì),即顯藍(lán)色,發(fā)生假陽性。所以嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。
第二,標(biāo)本受細(xì)菌污染:因菌體中或許含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶,因而,被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣,亦可發(fā)生非特異性顯色而攪擾測(cè)定結(jié)果。
第三,標(biāo)本保存不妥:在冰箱中保存過久的標(biāo)本,在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、構(gòu)成假陽性;為克服上述攪擾,ELISA試劑盒測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮收集;如不能當(dāng)即測(cè)定,5d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃,1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存;凍存后融解的標(biāo)本,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混合后再測(cè)定,但混勻時(shí)應(yīng)輕柔,不行激烈振動(dòng)。
第四,標(biāo)本凝結(jié)不全:在工作中,有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè),常在血液還未開始凝結(jié)時(shí)即強(qiáng)行離心別離血清,使血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在 ELISA 測(cè)定過程中能夠構(gòu)成肉眼可見的纖維蛋白塊,易構(gòu)成假陽性結(jié)果;因而血液標(biāo)本收集后有必要使其充分凝結(jié)后再別離血清。