細(xì)胞 凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”,這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多用二甲基亞砜(DMSO)作為保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性;緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的物理損傷。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
細(xì)胞凍存操作要點(diǎn):
1.細(xì)胞凍存前12~24h,換新鮮培養(yǎng)基,使細(xì)胞一直處于對(duì)數(shù)生長期。
2.待細(xì)胞長至80%匯合時(shí)胰酶消化,用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細(xì)胞懸液,1000rpm離心10min。懸浮細(xì)胞則直接離心。
3.棄上清,加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細(xì)胞懸液分至凍存管內(nèi),每管1~1.5mL,擰緊蓋子。在管壁上做好標(biāo)記,標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期等。(細(xì)胞凍存液配方可為胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=4:5:1或胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=1:8:1或胎牛血清:DMSO=9:1,可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件調(diào)整)
4.按下列順序依次降溫:室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便,細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃過夜,再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線;凍存5次后異丙醇需要跟換一次,以免影響凍存效果。
5.細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,檢測(cè)細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存,為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長情況,再繼續(xù)凍存。
細(xì)胞復(fù)蘇操作要點(diǎn):
1.將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱;準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管,加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2.將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫(可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中)。輕輕晃動(dòng)凍存管,使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍,使細(xì)胞能盡快通過zui易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,避免引起污染。
3.用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi),將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi),輕輕吹打液體,使細(xì)胞均勻分散,降低DMSO濃度,吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4.800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,吹打制成細(xì)胞懸液。
5.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi),補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6.第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況,換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代,細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
對(duì)DMSO不敏感的細(xì)胞在復(fù)蘇時(shí)也可不離心,減少操作步驟,也可降低污染的幾率。將解凍的細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi),補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,移除死 細(xì)胞 。