細(xì)胞表面抗原檢測一般步驟

1.實(shí)驗(yàn)材料：檢測管或96微孔板 一抗（FITC標(biāo)記），以表記Anti-CD19/FITC抗體為例

緩沖液：PBS（PH7.4）

設(shè)備：移液器、離心機(jī)、冰盒或冰箱、流式細(xì)胞儀

2. 注意事項(xiàng)：標(biāo)記抗體在使用之前用PBS溶解并振勻，并確認(rèn)沒有沉淀，迅速離心幾秒，使所有的液體都集中到管底，標(biāo)記抗體應(yīng)避光4℃保存，避免凍結(jié)，因樣本的固定保存或較長時間放置可能會影響細(xì)胞表面分子和抗體之間的結(jié)合，故建議盡可能使用新鮮樣品。

3. 操作方法：

一. 以大鼠淋巴組織細(xì)胞表面抗原的流式檢測步驟為例

樣品制備：

取出大鼠淋巴組織塊，迅速浸泡在10ml的緩沖液中，并用注射器的活塞研磨或使用兩塊預(yù)冷的載玻片研壓成單細(xì)胞。

把懸液轉(zhuǎn)移到50ml的錐形管中靜置片刻，使細(xì)胞團(tuán)塊和碎片沉降到管底，并通過尼龍網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液。

在4℃下300-400g離心4-5分鐘，除去上清液。

如果該樣品為脾臟細(xì)胞，加入一定量的RBC lysis裂解紅細(xì)胞，或者用分離液分離出淋巴細(xì)胞。若為其它樣品，不用此步驟。

加入50ml 緩沖液重懸細(xì)胞后計數(shù)，根據(jù)需要用臺盼藍(lán)（Trypan Blue）進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

離心細(xì)胞液并除去上清；用適量的緩沖液重懸細(xì)胞為2×107個/ml。采用直接標(biāo)記的一抗，則加入CD19/FITC抗體（0.5-1ug/106細(xì)胞）冰上孵育5-10分鐘。

細(xì)胞熒光染色步驟:

1. 在每個流式檢測管或板式微孔中加入50ul的稀釋后的一抗；在空白管/孔或同型對照管/孔中加入50ul 緩沖液。若進(jìn)行抗體*濃度測試，建議范圍2-0.03ug/106細(xì)胞。

2. 在各管/孔中分別加入50ul細(xì)胞懸液（約106細(xì)胞），并輕輕混勻。

3. 避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。 （注意：有些抗體可能需要更長的孵育時間，建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索）

4. 孵育完成后，加入緩沖液（每流式檢測管中加2ml，而每微孔中加200ul） 4℃下300-400g離心5分鐘，并棄去上清。

5. 重復(fù)洗滌過程3次。

6. 重懸細(xì)胞后上流式儀檢測。

7. 使用直接標(biāo)記一抗，用500ul 緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。 若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體，則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素（用緩沖液稀釋成合適的濃度）后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30分鐘。洗滌細(xì)胞兩次（參考第4步和第5步方法）。之后500ul緩沖液重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測。

8. 試驗(yàn)結(jié)果分析：（注：若要對多個細(xì)胞表面抗原進(jìn)行多色標(biāo)記，則同時加入熒光標(biāo)記抗體后按以上操作步驟進(jìn)行孵育和細(xì)胞洗滌；操作盡量保持在避光和4℃左右的溫度下進(jìn)行）

二．以人外周血細(xì)胞表面抗原的流式檢測步驟為例

1. 在每個流式檢測管或板式微孔中加入50ul的熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)稀釋后的一抗（抗體用緩沖液稀釋成合適的濃度）；在空白管/孔或同型對照管/孔中加入50ul 緩沖液。

2. 每管分別加入100ul全血，并輕輕混勻。

3. 避光孵育15-30分鐘。 （注：有些結(jié)合能力較低的抗體可能需要更長的孵育時間，建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索）

4. 每管分別加入2ml RBC lysis Buffer（之前預(yù)熱恢復(fù)至室溫），混合均勻。

5. 室溫避光孵育10分鐘，此孵育時間不要超過15分鐘。

6. 室溫300-400g離心5分鐘，并棄去上清。

7. 用2ml 緩沖液洗滌細(xì)胞一次。

8. 重懸細(xì)胞后上流式儀檢測。

9. 若使用的一抗是熒光直接標(biāo)記抗體，用500ul 緩沖液或2%的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。 若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體，則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素（用緩沖液稀釋成合適的濃度）后于室溫避光孵育15-30分鐘。洗滌細(xì)胞1-2次（參考第7步方法）。之后500ul或2%的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測。

10. 試驗(yàn)結(jié)果分析。 （注：若要對多個細(xì)胞表面抗原進(jìn)行多色標(biāo)記，則同時加入熒光標(biāo)記抗體后按以上操作步驟進(jìn)行孵育和細(xì)胞洗滌；操作盡量保持在避光條件下進(jìn)行）